专家解读 | CHO重组表达产品上市申报前遗传稳定性研究要求

2024年12月18日

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一：CHO重组表达上市申报前为什么要关注遗传稳定性？

CHO细胞因为其特殊的性能占据生物治疗性重组蛋白质应用方面的全球市场89%。CHO细胞能够适应无血清培养基的条件，可以悬浮培养利于生产放大；同时CHO细胞是可进行基因操作的，容易得到高产的单克隆细胞株，也可以进行类似的翻译后修饰。尤其值得注意的是，CHO细胞对于人类病毒的敏感性较低，非常利于生物制药的应用。但CHO的基因可塑性同样会表现为细胞的遗传不稳定性，如基因的重排、目的基因的突变、表观遗传学的基因沉默、以及基因扩增系统的多拷贝表达压力等。为了药品生产的持续稳定，监管机构对于CHO细胞的表型稳定性与遗传稳定性均提出了相应要求。

二：中美法规或指南对于遗传稳定性(CHO重组表达)是如何规定的？

—— 2.1

2020版中国药典《三部生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》规定:

生产者须具有该细胞用于生产的目的基因的稳定性资料，稳定性检测的项目及方法依据产品的特性确定，对于细胞基质来说，稳定性的分析是保证MCB/WCB 与 EOPC 之间的一致性，包括重组细胞的遗传稳定性（如插入基因拷贝数、插入染色体的位点、目的基因的序列等）、目的基因表达稳定性（目的蛋白序列与翻译后修饰结构）、目的产品持续生产的稳定性（产量与特性），以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。

—— 2.2

2020版中国药典《人用重组DNA蛋白制品总论》规定:

应对主细胞库的表型和基因型标记进行鉴定。应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因拷贝数、基因插入或缺失、整合位点数量等情况进行分析。核苷酸序列应与表达载体一致，并与所预期的表达蛋白质的序列吻合。

—— 2.3

2023版 CFDI 药品GMP指南-无菌制剂（下册）规定：

细胞基质的稳定性研究包含：传代培养过程中细胞基质的稳定性研究和贮存条件下的细胞库稳定性研究。前者指考察传代培养期间，细胞基质的稳定性和生产预期产品的一致性，后者考察细胞库在指定的贮存条件下，长期保存的一致性。传代培养过程中的稳定性研究包含表型稳定性研究和基因型稳定性研究。表型稳定性研究主要考察细胞基质传代过程中细胞倍增时间和产品质量的稳定性，基因型稳定性考察细胞基质在传代培养过程中重组 DNA 整合位点、目的基因侧翼序列、拷贝数和目标序列等基因水平上的稳定性因素。

—— 2.4

USP 1042或ICHQ5B规定:

MCB或WCB、EOPC与LIVCA, 通过基因表征证明携带 GOI 的表达构建体在整个预定的商业生产过程中的完整性。根据 ICH Q5B，基因表征包括四个方面：编码序列的验证、对整合位点的评估、评估表达构建体总体结构的完整性从而深入了解表达构建体的潜在插入和/或缺失、在生物制药生产运行所需的时间内确定一致的GOI拷贝数。

—— 2.5

WHO TRS 978规定:

需要各制造商与监管机构沟通，监控遗传稳定性，通常评估MCB/WCB与ECB或EOPC保持一致性。重组蛋白产品需要重点考察蛋白序列和翻译后修饰情况。并且蛋白表达的产率与性质需要保持一致，可以通过研究细胞培养过程的生长特性、代谢特性或其他表型标记物。对于含有DNA表达构建体的细胞系，应确定这些构建体在MCB/WCB和ECB或EOPC之间的稳定性。还应确定构建体的拷贝数，以及（如有必要）基因插入的染色体位点（细胞染色体侧翼区域进行测序，荧光原位杂交等方法可能在某个染色体位点存在基因插入片段时提供有价值的额外信息）。

三：遗传稳定性考察的项目有哪些？

—— 3.1

目的基因（GOI）序列分析

DNA水平分析方法包括Sanger测序、限制性内切图谱（RE）、Southern Blot、NGS全基因组测序；RNA水平分析包括：Northern Blot，RT-PCR + Sanger测序，NGS全基因组测序。

—— 3.2

目的基因拷贝数测定

基因拷贝数(copy number)是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组中出现的数目。丢失原因与目的基因插入到宿主细胞染色体中的稳定性、筛选压力、与整合位点、外源基因重组等等有关。通常采用qPCR或ddPCR法进行定量检测。

—— 3.3

目的基因侧翼区域序列分析

目的基因侧翼序列包括前导区、尾部区、调控区,调控区又包括启动子、增强子、终止子等，对于目的基因的表达与调控起到重要作用，同时也是影响遗传稳定性的重要因素。通常采用DNA的全基因组NGS测序分析进行检测。

—— 3.4

目的基因整合位点测定