抑制物？荧光PCR如何摆脱束缚，跑出漂亮曲线！

2024年06月07日

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《荧光PCR技术常见困扰专题》进入第三篇，继之前的污染和交叉后，本期我们谈谈qPCR实验的又一个重要影响因素：抑制物。

荧光PCR的主要功能性成分为DNA聚合酶，常用的为Taq DNA聚合酶。该酶具有5'-3'端DNA聚合酶功能和3'-5'核酸外切酶活性，此外Taq酶还需要有Mg2+作为辅助因子激活。一些常见的生物体液样本、细胞/细菌培养液、疫苗/蛋白/酶发酵液等样本含有大量的杂蛋白、无机盐和其他化学试剂。这些试剂如果作为待检测样本，如果无法将上述抑制物去除，轻则会导致曲线异常，重则会呈现假阴性结果。

被抑制的阳性扩增曲线和阴性扩增曲线如图1和图2所示，图3是一个无抑制的阳性扩增曲线。图1和图2显示了一个共同的特点就是基线期不平滑且有扩增后期上扬（非正常扩增）的情况出现。

▲ 图1 | 被抑制的阳性扩增曲线

▲ 图2 | 被抑制的阴性扩增曲线

▲ 图3 | 无抑制的阳性扩增曲线

常见的荧光PCR抑制物有哪些？

qPCR INHIBITOR

小

微

蛋白类抑制物：血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等大分子蛋白质，这种蛋白质可直接抑制taq酶活性，阻碍PCR反应的进行。

有机化合物：尿素（0.05mol/L以上）、叠氮化钠（0.1%以上）、苯甲酸钠（1%以上）、甲醛（1%以上）、十二烷基磺酸钠（SDS、5%以上）、吐温-20（1%以上）等物质在达到一定浓度后会可能会使Taq酶活性中心发生三级结构空间改变，使其失去结合引物—模板复合物的条件；或者竞争性结合Taq酶活性中心，阻碍Taq酶发挥作用。

血液抗凝剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA）、肝素。两者都可以螯合或吸附Mg²⁺，降低PCR体系中Mg²⁺的浓度，使Taq酶无法被激活；后者还可以代替引物-模板复合物作为Taq酶的竞争性底物。

金属离子：Ca²⁺、K⁺等。以Ca²⁺为代表的一类2价金属阳离子会与Mg2+竞争性结合Taq酶，但无法行使激活功能。当K⁺浓度达到0.075mol/L时，Taq酶会被完全抑制。

其他物质：例如可以改变PCR反应环境的pH值的物质、改变总离子浓度的物质、可变性Taq酶的物质等等都会对荧光PCR产生抑制。