消失的特异扩增带？看荧光PCR如何解决脱靶问题，拒绝假阴性！

图1 4条人类Alu基因序列比对图

也许会有小伙伴提出可以多设计几条探针，或者改变探针形式，再或者直接更换检测方法。上述的想法理论上可行，但是不具备可操作性。例如4条不同的序列可以设计4条探针，但是这样的话不仅实验成本会翻4倍，探针序列越多，对PCR体系造成的影响越大。此外，即便是4条探针也无法覆盖所有人的Alu序列。其次，无论探针形式如何变化（taqman、MGB、分子信标等等）都无法兼顾低成本和低脱靶率。

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理论上讲，任何一种检测方法都存在脱靶的概率。因此，我们只能尽可能的降低脱靶率，在成本和脱靶率之间做到收益最大化才是设计引物探针的前提。在此前提下，研发人员应该仔细考量每条序列的来源，若某条序列在非理论应用场景下才出现，则可以放弃检测该条序列。其次，在比对序列时尽可能选择多条来源的核酸序列，这样可以使比对的范围扩大，更明确的区分出保守区和非保守区。