关联审评"零发补"通过！微谱成功助力吉林敖东延吉药业产品获批上市
2024/10/12
微谱获CNAS认证：蛋白质 Edman N端测序丨金标准
2024年05月29日
就在这个5月初，谷歌旗下公司 DeepMind 与 Isomorphic Labs 发布了蛋白质结构预测领域的最新人工智能模型——AlphaFold3！这一消息无疑是令人振奋的，AlphaFold3的预测功能可以帮助科学家进行生物分子系统结构分析，从而加速甚至颠覆当前的药物研发模式。
▲ 图片来源 | nature
我们期待AlphaFold3能够揭开更多蛋白质结构的秘密，然而即使预测的准确性越来越高，科学的严谨性依然要求高效的预测进行精准的验证。对蛋白质结构的复杂性抽丝剥茧，科学家已经发现一切始于N端：蛋白质的合成和表达起始于N末端。对蛋白质N端序列的研究，Edman氨基酸序列测定法是其中非常成熟的方法之一。
为符合国内外法规监管要求，满足各药企伙伴药学质量研究方面的申报需求， 微谱生物制品质量研究实验室已建立了成熟完善的Edman降解法用于测定N端氨基酸序列，并顺利通过CNAS官方检测能力认可。
▲ 微谱生物药实验室Edman N端测序获CNAS认可
Edman氨基酸序列测定法
蛋白质的一级结构(primary structure)是指蛋白质多肽链的氨基酸序列。一般来说，一级结构由蛋白质的 N端(氨基末端)到 C端(羧基末端)。一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于一级结构即多肽链的氨基酸序列中。由此可见，一级结构是蛋白质功能和作用的基础，因而需要对一级结构进行充分的确证。
▲ DNA蕴含着复杂的蛋白质结构信息
一 概述
Edman 氨基酸序列测定法，又称 Edman 降解法，由埃德曼(Pehr Edman)在20世纪50年代创立。该方法切割肽段或蛋白质的N端的第一个氨基酸，对切割的氨基酸进行鉴定，切割后的下一个氨基酸成为新的 N 端氨基酸，又可循环进行切割和鉴定。每一个循环可测定一个氨基酸，按循环顺序进行排列即可得到氨基酸的序列信息。
二 原理
Edman氨基酸序列测定法的主要过程如图1所示,包含耦合、切割、萃取、转化和鉴定。
▲ 图1:Edman氨基酸序列测定法的主要过程示意图 | 来源：参考文献2
第一步
在pH 约 9.0 的碱性环境下,蛋白质N端的氨基酸与异硫氰酸苯酯(Ph-N=C=S，PITC)耦合,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物。
第二步
苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物与三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)发生反应,选择性地切割蛋白质 N 端的第一个肽键,使该氨基酸残基游离,生成噻唑啉酮苯胺(ATZ)衍生物。
第三步
萃取出释放的氨基酸衍生物,并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)。
第四步
以液相色谱法分析转化后的 PTH-氨基酸种类。PTH-氨基酸的出峰顺序受流动相和色谱柱的影响,一种经典方法的出峰顺序是天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、谷胱酰胺(Q)苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、色氨酸(W),苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)和亮氨酸(L)。根据 PTH- 氨基酸混合标准品的出峰时间推测氨基酸种类。
三 氨基酸序列分析仪
基于 Edman 氨基酸序列测定的步骤，仪器公司推出了氨基酸序列分析仪，包含两大模块，分别是样品处理模块和液相分析模块。样品处理模块可实现样品的耦合、切割、萃取和转化的自动化处理并自动对得到的 PTH-氨基酸进行液相分析，鉴定得到氨基酸类型。微谱生物药质量研究实验室采用岛津蛋白质测序仪PPSQ-53A，除了测定标准氨基酸外，还可以测定非标准氨基酸。
▲ 图2：岛津蛋白质测序仪PPSQ-53A与混合标准品校准测试图谱
四 应用
《中国药典》(2020 年版)、欧洲药品管理局(EMA)《生物类似药指南》、ICH Q6B 等多个文件中均对N端氨基酸序列的分析提出了要求，N端氨基酸序列可评价生物药物的均一性，如发现N端氨基酸存在异质性，需采用合适的方法对含量进行控制。
例如《中国药典》(2020年版)三部通则尼妥珠单抗注射液、康柏西普眼用注射液等都对 N 端氨基酸序列提出要求如下:
N端氨基酸序列用氨基酸序列分析仪或质谱法测定(至少每年测1次)
生物药中，尤其是单抗，蛋白质 N端的氨基酸常发生焦谷氨酸环化，发生焦谷氨酸环化后异硫氰酸苯酯无法与N端的氨基酸耦合，无法继续后续的切割、萃取和转化。为了解决该问题，需向样品中加人焦谷氨酸氨肽酶进行酶切，切除蛋白质端的焦谷氨酸生成新的N 端氨基酸，才可使用Edman 氨基酸序列测定法进行分析。
参考文献
【1】《生物药物分析》高向东 人民卫生出版社ISN978-7-117-33493-8
【2】Zhang H, Wang B, Seehafer K, Bunz UHF. Sensor Array Based Determination of Edman Degradated Amino Acids Using Poly(p-phenyleneethynylene)s. Chemistry. 2020 Jun 23;26(35):7779-7782. doi: 10.1002/chem.202001262. Epub 2020 May 29. PMID: 32181541; PMCID: PMC7383564.
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