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2024/10/12
大咖说丨生物制品的工艺相关杂质研究
2023年08月29日
前言
#微谱药研院 系列推送「生物制品的工艺相关杂质研究」今日启幕，第一期为您综述生物制品常见工艺相关杂质的控制策略，基于对ICH Q2 分析方法验证指导原则及生物制品中不同来源的杂质的理解，总结生物活性大分子类的工艺相关杂质、非生物学活性工艺相关杂质、低分子量工艺相关杂质的风险评估要点。我们以专业的生物制品工艺相关杂质研究团队，建立包括但不限于文内表1中杂质的高灵敏度分析方法，从杂质的方法开发、验证及检测，均满足相应的法规及申报要求，以此本系列推送为介，与您共探生物制品的工艺相关杂质研究，欢迎留言探讨。
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生物制品是指应用生物技术，以细胞、微生物、动物或人的组织或体液为原料制成的用于预防、诊断、治疗的药品[1]。生物制品的工艺相关杂质（Process-related impurity, PRI）指在生产工艺中产生的杂质[2]，可能会影响产品的安全性与有效性，因此，需结合工艺相关杂质的清除研究、人体暴露量和安全性阈值进行风险评估，对于确定可以经由纯化工艺去除的风险较小的工艺杂质残留物质，可以不纳入质量标准中[3]。
生物制品的工艺相关杂质可能来源于细胞基质，如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA；细胞培养物，如诱导剂、抗生素或培养基成分；下游工艺，如处理试剂或柱子析出物[2]。
生物制品常见的工艺相关杂质控制策略如表1所示。生物制品的研发与生产工艺较复杂，对于工艺过程中引入的工艺相关杂质应根据工艺的去除能力、杂质的物理化学性质、毒理学相关数据进行立体的安全性风险评估，必要时应借助先进的分析技术手段对产品的杂质含量进行控制，以确保药物的安全性与有效性。
表1 生物制品常见工艺相关杂质的控制策略
对于具有生物活性大分子类的工艺相关杂质，如表2所示，已有相关文献及药典结合已有的研究数据，给出了明确的安全限度范围。
表2 生物活性大分子类工艺相关杂质
然而，很多上游工艺相关杂质，如MSX、DMSO、维生素、消泡剂、泊洛沙姆等；下游工艺相关杂质，如EDTA、缓冲液与溶剂等。这类杂质与具有活性的大分子类工艺杂质相比，具有相对更低的分子量，由于本身相对分子量太小而不能引起免疫原性[6]，因此免疫风险相对更低，甚至可以忽略。但是，基于药物使用的安全性考虑，还是需要运用科学有效的技术手段对低分子量的工艺相关杂质进行风险评估。
有法规及文献报道的杂质类型有对应的PDE值，可以使用该方式进行安全性风险评估。每日允许暴露量（Permitted Daily Exposure,PDE）指药物中残留杂质每日可接受的最大摄入量，是由大多数相关动物研究中的未观察到作用水平（No-Observed Effect Level, NOEL）或观察到作用的最低水平（lowest-observed effect level , LOEL）得出的[7]，PDE值越大，说明越安全，且杂质分析方法的定量限（Limit of Quantitation, LOQ）会参考PDE值[8]。
长期治疗用药物（＞10年）中存在且无致癌性数据的致突变杂质，可以使用毒理学关注阈值（Threshold of Toxicological Concern, TTC）进行安全风险评估，这类低分子量杂质的分析方法定量限值（LOQ）与TTC值有关，并通过比较产品剂量中的杂质含量与TTC值（通常为1.5μg/天的杂质限度[9]）的大小来进行风险评估。
但对于大多数的非生物学活性工艺相关杂质没有对应的PDE值，本身分子量小，理论上不存在免疫原性，也没有致突变的数据。基于这种情况，杂质安全因子ISF（Impurity Safety Factor）的安全风险评估方式应运而生，体现了杂质的毒性剂量与杂质在单位剂量中的含量倍数关系，进而评价工艺对杂质的去除能力，计算公式为：
（LD50指该杂质在动物实验中使一半动物死亡的剂量；单位剂量中的杂质含量，指单位剂量中可能引入的最大杂质含量=杂质浓度/蛋白浓度*最大给药剂量）。
ISF值越大，说明该杂质在单位剂量中的含量与其毒性剂量之间的差距越大，安全性风险越小。如果ISF≥1000时，代表着最小风险，可认为是安全的[10]。当使用合适的技术方法进行该类杂质的检测时，结果为“未检测到”时，可以使用LOQ作为该杂质的含量代入公式计算[4]。
关于ISF的具体运用，详见表3所示，运用以上公式计算某工艺阶段中的甲氨蝶呤杂质ISF为135440，远远大于1000，说明该杂质的含量水平是安全的。
表3 甲氨蝶呤的ISF安全风险评估[11]
通常，根据毒理学风险，将低分子量工艺相关杂质分为A、B、C三个类别[4]，如图1所示。图1中A类杂质被认为是安全的，属于低安全风险（Low Safety Risk），如很多上游工艺营养物质：氨基酸、维生素、盐、脂类、碳水化合物和微量元素等。对于下游工艺的大多数缓冲液与盐（如醋酸钠和氯化钠）在美国FDA“一般认为安全”（Generally Recognized as Safe, GRAS）清单中被认为是安全的；关于赋形剂（如聚山梨酯80和精氨酸）在已上市药物中也被认为是安全的。C类杂质（如亚硝胺类）具有极高的安全风险，容易引起急性严重毒性（如致癌和基因毒性），而B类杂质位于A与C类之间，属于中等安全风险。对于B类与C类杂质，安全风险评估需要运用科学有效的技术手段，将产品单次剂量中的杂质含量与确定的安全剂量进行比较，并且对于不同的类型的杂质，可以使用不同的技术手段[4]。
如图1所示，当低分子量相关杂质已知是安全的，将认为是低风险的；该物质如果不是已知低风险相关杂质，就会进行B1、B2与C分类归属去评估。对于2a与2b中，当低分子量相关杂质的ISF大于特定的值，或者暴露剂量小于PDE或TTC时，可将其归为安全低风险相关杂质。如果不满足2a或2b的条件，相对应工艺相关杂质的分析方法需要进行改进，如灵敏度的提高，或者进行相关的工艺优化，以确保工艺相关的杂质的质量可控。
图1 低分子量工艺相关杂质风险评估流程[4]
基于对ICH Q2[12]分析方法验证指导原则及生物制品中不同来源的杂质的理解，微谱生物制品工艺相关杂质研究团队建立了包括但不限于表1中杂质的高灵敏度的分析方法，从杂质的方法开发、验证及检测，均满足相应的法规及申报要求，助力客户完成工艺杂质的清除评价及质量可控。
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【参考文献】
1. 国家药典委员会, 中华人民共和国药典（三部）. 北京：中国医药科技出版社, 2020.
2. ICH, Specifications : Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Harmonised tripartite guideline Q6B, 1999.
3. 李怡君，何伍，魏开坤, 生物制品分析方法的生命周期管理. 中国新药杂志, 2023. 32(2):8.
4. Luo, H., et al., Safety risk management for low molecular weight process-related impurities in monoclonal antibody therapeutics: Categorization, risk assessment, testing strategy, and process development with leveraging clearance potential. Biotechnol Prog, 2021. 37(3): p. e3119.
5. 国家药典委员会, 中华人民共和国药典（三部）《尼妥珠单抗注射液》. 北京：中国医药科技出版社.
6. David Izhaky, I.P., What else can the immune system recognize. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998. 95(20):11509-11510.
7. ICH, Impurities: Guideline for Residual Solvents. Harmonised Guideline Q3C(R8), 2021.
8. ICH, Guideline for Elemental Impurities. Harmonised Guideline Q3D(R1), 2019.
9. ICH, Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. Harmonised Guideline M7(R1), 2017.
10. Mark A. Schenerman, M.J.A., Cynthia N. Oliver, Kripa Ram, and Gail F. Wasserman, Using a Risk Assessment Process to Determine Criticality of Product Quality Attributes. Wiley-Blackwell, 2008.
11. Group, C.B.W., A-Mab: a case study in bioprocess development. 2009.
12. ICH, Validation of analytical procedures. Harmonised Guideline Q2(R2), 2022.
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