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2022/06/07
海口站速记大放送丨生物大分子结构表征及工艺杂质研究
2021年07月09日
在2021海南自贸港首届国际医药研发高峰论坛下午场环节中，作为受邀发表演讲的重要嘉宾，微谱生物大分子研究中心技术总监黄卓先生，以“生物大分子结构表征及工艺杂质研究”为题，为现场500位专业观众进行了知识分享。
生物大分子结构表征及工艺杂质研究
海口站速记大放送
“通过各种灵敏的分析手段综合评价蛋白产品的一级结构、高级结构及生物活性等理化特性，以确保产品的安全性跟有效性。”
黄卓
微谱生物大分子研究中心 技术总监
个人简介：十余年深耕于生物药领域，从事对单抗、融合蛋白、多肽类生物制品的理化分析、结构表征及杂质鉴定工作，如Humira、BNP、Erbitux、Aflibercept、HyFc-EPO等多款生物类似药、创新药，尤其对工艺条件、强制降解条件（高温、酸碱、光照、氧化等）对蛋白样品的修饰鉴定，支持过多个项目的CMC项目管理，并将其由临床前推动至临床阶段的项目经验。
一、大分子的结构表征
说到大分子的结构表征，从各国法规层面来讲，无论是中国药典、FDA还是ICHQ6B都对大分子的结构确认做了相关描述，并说明了研究的必要性。总结来说，通过各种灵敏的分析手段综合评价蛋白产品的一级结构、高级结构及生物活性等理化特性，以确保产品的安全性跟有效性。
去年，药监局第43号令对生物制品进行了新的注册分类。生物制品分为三个部分：第一部分是疫苗类的生物制品，第二部分是治疗类的生物制品，第三部分是关于按照生物制品进行管理的诊断试剂。我们看到，新注册分类相比以往的分类减少了很多，尤其是按照功能性进行了区分，体现出了生物医药的创新性。
关于特性鉴定，从目的和策略来讲，特性鉴定不仅能深度表征产品的一级结构和高级结构信息，而且在一定程度上也能比较各批次产品间的批间一致性。所以，特性鉴定可以从相对简单的一点分子量检测到进一步的亚基分子量、序列覆盖率、N/C端序列等的分析剖析。再深层，可以对蛋白分子做一些更精细的分析，包括质量肽图、二硫键、糖基化修饰等高级的检测。
下图就是常规的抗体图，可以看到相对来说它的结构分子量比较大，结构比较复杂。基于这个原因，我们要从各个维度，从分子量、氨基酸组成、序列覆盖度以及更高级维度确定结构跟预期是否一致。同时也会结合一些理化的特性，包括分子大小的变异体，免疫学功能生物学活性，包括FC功能生物学活性等进行区分。总得来说，结构表征广泛应用于生物制品开发应用当中。
1.「常规表征类项目」案例
首先是分子量的全序分析，分子量好不好不光看信号值高不高，还要分辨好不好。序列分析有所不同，除了看信号值好不好，也要碎片化的离子匹配的数量多不多，越多说明可信性越高。
序列覆盖率是另一个维度，分子量较大的分子没有办法直接进质谱进行表征分析，所以需要对它进行前处理的操作，使得它在这个质谱里面呈现比较好的相应信号。我们要求，无论一级还是二级的序列覆盖率，都需要达到100%。
质量肽图是液相肽图分析的一个补充，能对色谱峰的每一个肽段进行序列归属，包括鉴定CDR肽段的位置，从而保证蛋白序列的完整性和稳定性。
N糖糖谱分析，糖蛋白的糖链对维持蛋白空间结构的稳定性和生物活性起着重要的作用，同时也能影响许多蛋白药物的安全性。用这个方法，不仅可以看到各种糖型的型号，也可以看到相对的比例。
二硫键是一种重要的蛋白质翻译后修饰，对维持蛋白质空间结构起着重要的作用，也对其生物活性影响重大，因此确证蛋白分子正确的二硫键配对方式是特性鉴定中重要的研究内容。
2.「PEG重组蛋白修饰位点确认」案例
由于PEG重组蛋白分子不均一，且PEG易带多个电荷，因此PEG蛋白结构鉴定及修饰位点确认存在一定的挑战。
对于这样的一个比较难的案例，我们单用一种方法做很难做出来的，而是要采用循序渐进的研究方式。生物制品的分析往往不是单一的手段确认，而是采用多功能的手段从不同角度去分析同一个问题，最终确认结果。
二、工艺杂质研究
因为最近几年中国刚加入ICH成员国，我们看到很多的杂质研究依然不充分。首先，看一下指导原则里面是怎样进行划分的。工艺相关杂质指的是在杂质里面涉及到的一些宿主细胞蛋白质、宿主细胞质的脱落抗体或配基、细菌内毒素、纯化试剂/工艺步骤等添加物，如消泡剂、胰岛素、有机溶剂、抗生素、蛋白酶等。这些都是在工艺当中引入，需要用特定的手段去除或者达到可接受的标准。基于这样的指导背景，我们开发出了相应的研究方案。
1.「二甲基硅油残留研究」案例
二甲基硅油是一种聚合物，且无紫外吸收，因此对于它的残留检测一般采用HPLC-ELSD/CAD等。在医药领域二甲基硅油可以用于发酵液的消泡。但其属于工艺相关杂质，且存在一定安全性影响，因此还需控制其限度水平。
2.「204消泡剂残留研究」案例
204消泡剂是由多种无硅酮有机消泡剂的混合物，不是来源于动物或者植物，它是通过化学合成得到，可反复灭菌。也是跟上面一样做出这样的一个检出，灵敏度达到10ppm的水平。
3.「泊洛沙姆残留研究」案例
常见的泊洛沙姆有poloxamer188, poloxamer407等,由于泊洛沙姆是一种聚合物，且无紫外吸收，因此对于它的残留检测一般采用HPLC-ELSD/CAD等。
泊洛沙姆（Poloxamer）是一类新型的高分子非离子表面活性剂，可以作为乳化剂和稳定剂使用，通常在发酵工艺中加入一定比例的泊洛沙姆能提高发酵液的乳化效果和稳定性。这个灵敏度可以达到10ppm的水平。
4.「吐温降解研究」案例
吐温生物制品是非常常见的辅料。吐温含量检测通常采用HPLC的方法，这个缺点是无法监控吐温的降解途径和降解产物信息。我们也是开发了相应方法，利用衍生试剂结合HPLC-UV分析吐温降解产物，该方法可以同时分析一系列游离脂肪酸，检测下限为1 ppm。
5.「蛋白残留研究」案例
客户生产工艺中加入了某种蛋白（酶），需要在成品中对其含量进行控制，但由于限度要求较高，需在10ng蛋白以下，因此无法用HPLC-UV的方法进行检测，以银染法的方式可以做到。
这里面还会涉及到常规的IPTG、MSX、EDTA等生物制品里面偶尔用到的工艺添加物，时间关系不多赘述。
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