专家解读！腺相关病毒体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿）

导语

刚刚过去的7月，CDE发布了《腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》，对规范基因治疗产品研究具有重要意义。

在指导原则中所明确的基因治疗产品一般通过将外源基因（或基因编辑工具）导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正、增加或敲除特定基因以发挥治疗作用。可分为体内（in vivo）基因导入和体外（ex vivo）基因导入两种方式。体内基因治疗产品将外源基因（或基因编辑工具）通过适当的载体直接导入人体发挥治疗作用，而体外基因治疗产品是在体外将外源基因（或基因编辑工具）导入细胞，制备成为经基因修饰的细胞或细胞衍生产品，最终经回输以发挥治疗作用。

对于体内基因导入型的产品，市面上最受欢迎的几类是慢病毒lentivirus载体、腺病毒adenovirus载体、逆转录病毒retrovirus载体，及腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体。近几年，AAV因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势，已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

生产用物料是指产品生产过程中所使用的生物或化学材料， 包括起始原材料、生产过程使用或添加的物料、辅料，以及生产用耗材等。对于菌毒种库，需按照ChP要求进行检定；细胞库除了检定报告还需要溯源信息，传代稳定性研究结果应能支持临床研究用样品的生产。

在《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》提到，产品生产涉及包装质粒、包装用病毒等制备，也应提供相应的药学研究信息，具体和同类型生物制品原液的申报资料要求保持一致。

申报资料须明确临床研究用样品的生产厂和检验厂，提供基本的生产工艺信息，包括批次定义、生产规模、工艺流程、 具体的工艺参数和过程中控制信息等。AAV载体类产品相关杂质种类较多如空壳病毒等，一般需要通过多个工艺单元进行分离纯化；在关键工艺步骤设立与产品质量、杂质清除、回收率等相关的中控指标。

拟用于临床的生产批次，常见项目如无菌/生物负荷、内毒素、支原体、 螺原体（SF9细胞或生产过程中使用了植物源性成分）和外源病毒因子（收获液阶段常规展开，或采用NGS等高灵敏的方法）等检定，而对EOP细胞至少进行一次全面的检定。对于生产工艺引入病毒清除/灭活工艺单元的，病毒降低量应能达到≥4log10的病毒清除/灭活效果。

基本沿用《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》在生产工艺条款中提到的要求。

从质量研究角度看，上市申请阶段，质量研究一般应至少包含代表性临床样品批次和商业化工艺验证批次。AAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺确定，一般包括（但不限于）：鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、安全性相关检测等。

病毒载体的结构和理化特性研究一般包括全基因组的序列分析，衣壳蛋白的分子量、氨基酸序列和翻译后修饰研究，病毒颗粒的衣壳蛋白比例、热稳定性、颗粒形态和粒径分析等。

AAV载体的含量、纯度和活性分析一般包括病毒载体的滴度（如病毒颗粒数、基因组滴度、感染滴度等）、衣壳蛋白的纯度、病毒颗粒纯度、比滴度、转导活性等。电镜法和分析型超速离心技术（AUC）是目前业内AAV空壳率检测的两种重要方法。

AAV载体类产品具有较高的异质性，相关杂质分析如空壳病毒、不完整包装病毒、游离衣壳蛋白、游离核酸、DNA错误包装、病毒聚集体、可复制型AAV等。

从质量标准角度看，AAV类产品质量标准常见包括一般检查（如外观可见异物不溶性微粒、渗透压、pH值、装量、粒径等）、鉴别（单链/自身互补型双链、基因组鉴别和衣壳蛋白鉴别）、活性、滴度（基因组滴度、感染滴度等）、比滴度、纯度、产品和工艺相关杂质、可复制型AAV、无菌、内毒素、关键辅料含量等。

生产工艺如使用了风险较高的生产用细胞，如肿瘤细胞系、或携带病毒来源序列的细胞（如HEK293T细胞），建议持续收集残留宿主细胞的DNA片段大小和残留水平数据。

分析方法包括方法学原理、分析仪器、试剂耗材、操作步骤、数据处理、结果分析和结果判断等。可复制型AAV作为AAV类产品中重要的控制项目，应针对不同血清型AAV产品建立敏感、适用的分析方法。

基于标准品/对照品的特性和使用目的，进行特性分析（如结构、活性、纯度、 含量和其他特性等）、标定和稳定性研究，并确保数量足够用于研究和生产。